低品位磷矿和生物浸出技术

    磷是重要的化工原料，也是农作物生长的必要元素，工业用磷必须大量从磷矿中提取，虽然我国的磷矿资源比较丰富，已探明的资源储量132.4亿t，但平均品位只有16.95%（以P₂O₅计），而目前工业上制取磷酸要求磷矿石含P₂O₅≥28%川。所以如何充分利用低品位磷矿资源，已成为一项具有可持续发展战略意义的任务。     随着生物技术的迅猛发展，在湿法生物冶金工业中，采用细菌浸出低品位金属硫化矿物得到了广泛应用，不过目前多用于浸出金、铀、铜等的硫化矿物中，而应用于浸出磷矿还比较少见。一些有机化能异养细菌，如根瘤菌（Rhizobium）、假单胞菌（Pseudomonas）等可以利用葡萄糖等有机物生长，产生有机酸分解磷矿。不过异养菌代谢所产生的有机酸酸性不强，分解磷矿速度缓慢，而且需要添加有机营养物质作为生长所需的碳源，所以在工业应用时会受到很大的限制。而无机化能自养型微生物可以直接从空气中固定CO₂作为碳源，以氧化某些还原态无机物（如S⁰、FeS₂、Fe^2＋等）获得能量自养生长，产生无机强酸（如H₂SO₄等），可使磷酸盐溶解，既可以降低成本，又可以大大加快浸出速度。本研究使用生物冶金工业中常用的无机化能自养型微生物－嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferooxidans，At. f）和嗜酸氧化硫硫杆菌（Acidithiobacillus thiooxidans，At.t）来浸出低品位的磷矿，这两种细菌能够利用还原态的硫化物或亚铁作为能源物质，产生硫酸来分解磷矿石。采用紫外线照射和微波的物理诱变手段对其进行耐酸和产酸诱导育种，对比原菌进行浸矿试验，并研究了在浸出过程中添加吐温系列表面活性剂对其浸出效果的影响。     一、试验方法     （一）菌种准备     本试验所用的At. f和At. t是从安徽某煤矿的酸性矿坑水中采样，经富集培养、分离、纯化得到，细菌培养所用的培养基成分见表1，按表1比例配制好后，放人高压灭菌锅在121℃和压力0.10 MPa的条件下湿热灭菌30 min，亚铁溶液采用0.22μm的一次性针头过滤灭菌，亚铁溶液和硫粉都是在用时按比例加入培养基。固体培养采用双层固体培养基，下层为涂布红醉母菌的营养琼脂培养基，上层为涂布At. t或At. f菌的Starlcey或9K固体培养基，培养基营养成分与相应的液体培养基相同。其中硫粉用10% Na₂S₂O₃代替，用量为每100 mL加1mL，用2%的琼脂作凝固剂。两种细菌所用培养基成分见表1。 表1  两种细菌所用培养基成分

组分	At.f		At.t
	9K	Leathen	Starkey	ONM
（NH4）2SO4/g	3	0.15	0.3	2
KCl/g	0.1	0.05		0.5
K2HPO4/g	0.5	0.05	3.5	4
MgSO4·7H2O/g	0.5	0.5	0.3
Ca（NO3）2/g	0.01	0.01g
FeSO4·7H2O	14.78%	10%	0.01g	0.01g
CaCl2/g			0.25	0.3
S/g			10	10
蒸馏水/mL	700	1000	1000	1000
pH	3.0	3.0	2.4	2.0～3.5

     （二）紫光诱导试验     采用15 W的紫外灯，预热20 min后，将菌液放置在距离灯30 cm处，并用布将外界光线遮住，分别照射1、5、10、15 min。照射结束后放置在暗处，在0℃冷藏1 h。     （三）微波诱导试验     吸取一定量处于对数生长期（培养3d左右）的菌液，在2000 r/min的转速下离心10 min除去硫粉颗粒，吸取上清液10 mL注入培养皿中，放人微波炉（2 450 MHz，850 W）中进行诱变处理一定时间。诱变结束后进行稀释平板涂布，放入生化培养箱倒置培养。     （四）浸磷试验     试验所用磷矿样品取自湖北钟祥磷矿，原矿经破碎、磨矿至－200目作为浸出试验用样，磷矿品位为16.19%。在250 mL锥形瓶中加人100 mL培养基，接种10%体积的细菌培养液，表面活性剂试验中还需在接种时加入定量的吐温系列表面活性剂，然后加人1g磷矿粉，在摇床中振荡培养（温度30℃，转速120 r/mm），每天检测溶液pH值，并用蒸馏水补充液体蒸发量。     （五）分析测试方法     取一定量浸磷溶液的上清液，经过稀释后采用过硫酸钾消解－钼锑抗分光光度法（GB11893－89)用721型分光光度计测定溶液的几P₂O₅含量。培养及浸矿时溶液的pH值用奥立龙818型酸度计测量。细菌生长形态和细菌计数用Nikon CLPSE生物显微镜观测。     二、结果与讨论     （一）细菌生长曲线     用光学显微镜观察发现，菌体呈短杆状或棒状，细菌个体很小，宽0.5～1.0μm，长1.0～2.0μm，能游动，成单生、对生或短链纵生状态。半固体穿刺培养表明其为好氧细菌，革兰氏染色呈阴性。At.t菌、Af. f菌微波诱变培养过程中pH值变化曲线分别见图1、图2，At.t菌、Af.f菌紫外诱变培养过程中pH值变化曲线分别见图3、图4。 

图1  At.t菌微波诱变培养过程中pH值变化曲线 ■－0S；●－5S；▲－10S；▼－15S；t－30S；u－60S  图2  At.t菌微波诱变培养过程中pH值变化曲线 ●－0S；■－5S；®－10S；▲－30S；▼－60S 

图3  At.t菌紫外诱变培养过程中pH值变化曲线 ®－0min；▼－1min；■－5min；●－10min；▲－15min 

图4  At.f菌紫外诱变培养过程中pH值变化曲线 －0min；●－5min；■－10min；▲－10min     从图1、图2、图3和图4中可看出，在培养的前几天，pH值都会小幅度上升。这是因为细菌生长初期耗酸较多，而此时细菌正好处于迟滞期产酸不多所致；然后开始下降。总体来讲，诱变后的菌种大多比没有处理的菌种的pH值下降得更多。在同样条件下，培养7d后，紫外线诱变5 min的At. t菌，最终菌液pH值可降低至1.2，微波诱变10日的菌液pH值可降低至1.45；而At. f菌紫外诱变效果不明显，因为其培养基含有亚铁离子，色度较深，对紫外线具有很大的屏蔽效果，微波诱变l0 s时，菌液pH值可以降低到2.0以下，效果还可以。当紫外照射时间15 min时或微波处理60 s时，大多数细菌被杀死，所以菌液的pH没什么变化。试验结果表明经过适当诱变育种后的细菌产酸能力有所增强。     （二）浸矿试验结果     细菌浸出磷矿矿样的过程中，体系pH值同样会先升高，除了细菌外，磷矿也会大量耗酸，随着细菌的大量繁殖，浸矿体系的pH值不断降低，浸矿15d以后基本趋于稳定。总体来说，细菌对磷矿的浸出率随浸矿时间不断提高。从细菌浸出机理可以看出，磷的浸出是靠细菌氧化还原态的硫产生的硫酸把磷从矿石中浸出，所以影响浸磷最主要的因素也就是溶液的pH值，从前面细菌培养试验可以看出诱变细菌的产酸能力有较大增强，这里可以看出对应菌种的浸磷能力也较强。在相同试验条件下，浸矿20 d后各菌种对磷矿的浸出率见表2。 表2  诱变菌株对磷矿浸出20d后浸出率

菌种	紫外线照射诱导时间/s					微波诱导时间/s
	0	60	300	600	900	5	10	15	30	60
At.t/%	27.03	28.20	30.14	26.68	24.20	28.76	32.74	30.09	32.08	13.51
At/f/%	21.08			25.10	14.30	19.05	26.20		30.14	10.15

     （三）表面活性剂的影响     为了提高磷矿的浸出速率和浸出效果，在Star－key与9K培养基中，加入了几种吐温类表面活性剂（Tween 20、60、80），对其用量和种类两个因素的影响进行试验，结果见表3。 表3  加入表面活性剂后菌株对磷矿浸出20d后浸出率

菌种	Tween20用量/（g/m3）			Tween60用量/（g/m3）			Tween80用量/（g/m3）
	10	100	300	10	100	300	10	100	300
At.t/%At/f/%	35.5419.87	26.5125.31	25.5318.54	37.2518.47	31.2016.23	24.1514.11	23.4132.27	30.1415.21	25.5418.34

     吐温系列表面活性剂对At. t菌有较好效果，特别是吐温60，可以较大地提高磷的浸出率。其原因可能是因为At.t菌的主要营养物质S，其表面疏水，加入培养基后悬浮于液面，需要几天才能分散在培养基中，细菌不能充分利用；加入表面活性剂后，悬浮在表面的单质硫可以很快地在溶液中分散，使得细菌可以充分附着在硫粉表面，大大提高了产酸效果，从而提高浸出效果。相反对于At. f菌，吐温的作用就不十分明显，而且大多数情况反而不如不添加表面活性剂，这可能是因为At. f菌对于环境的表面张力比较敏感。根据II. M. Conoxcexxim等研究表明有时降低介质表面张力能够明显地抑制细菌的生长，当介质表面张力降低到30×10^－5N/cm时，一些细菌几乎停止生长。     三、结论     （一）采用At. t和At. f菌浸出磷的试验表明，对于低品位磷矿的浸出是完全可行的。     （二）使用物理诱变手段对菌种进行耐酸产酸培养可以提高浸出率，使用紫外线诱导At. t菌5min可获得较好效果；At.f菌采用紫外线诱导的效果不明显。使用微波诱导10s育种对两种硫杆菌都具有较好效果。     （三）添加表面活性剂可以进一步提高浸矿效果，对At.t菌而言，添加表面活性剂效果不明显。